DIÓXIDO DE CLORO, LA MOLÉCULA MILAGROSA. Amor a primera vista

En los albores del año 2009, en la génesis de la fundación de Homclinic como empresa de bioseguridad, sus miembros buscaban obsesivamente una molécula poderosa que garantizara una fase importante de su procedimiento de descontaminación (Patente en Proceso).  Es asi como uno de esos apasionados días de investigación y estudios, nos topamos con  ésta molécula de un nombre un tanto confuso;  «Dióxido de Cloro» (¡pero nada tenía que ver con  la lejía!).  Con sed escudriñamos el artículo que nos llevó a aguas más profundas.  De ahi nació un «Amor a Primera Vista»  con un una molécula de la cual no nos separararíamos jamás.   Iremos conociendo el mundo del Dióxido de Cloro y sus múltiples usos en beneficio de la humanidad.

En el otoño de 2001, la diseminación de esporas virulentas de Bacillus anthracis (el agente causante del ántrax) por medio de cartas enviadas a través del Servicio Postal de los Estados Unidos dio lugar a la contaminación de numerosos edificios, ya sea directamente (por ejemplo, la manipulación de las cartas contaminadas) o secundariamente (contaminación cruzada). Los edificios contaminados incluían oficinas de los medios de comunicación, instalaciones postales, el Capitolio, las instalaciones postales del Departamento de Estado y del Departamento de Justicia y residencias (4, 5). Se determinó que varias de esas instalaciones tenían una contaminación mínima, probablemente debida a la contaminación cruzada, sobre la base del bajo número de muestras de superficie que daban positivo a la presencia de esporas de B. anthracis. Esas instalaciones contaminadas cruzadamente se repararon utilizando métodos de tratamiento de la superficie, como el blanqueador y/o el dióxido de cloro líquido (DC), con la eliminación de los artículos contaminados. Sin embargo, los edificios directamente contaminados, en los que los trabajadores desarrollaron síntomas de ántrax por inhalación, se sometieron a limpiezas complejas, prolongadas y costosas utilizando la fumigación como principal instrumento de rehabilitación. Dos fumigantes clave, el peróxido de hidrógeno vaporizado (VHP) y el gas CD, se utilizaron en la descontaminación; el gas CD se utilizó en la limpieza del edificio de oficinas del Senado de Hart, el Centro de Procesamiento y Distribución de Correo de Brentwood, el Centro de Procesamiento y Distribución de Trenton y el edificio de American Media, Inc. en Boca Ratón, Florida .Se ha demostrado que el gas CD es virucida , bactericida y esporicida . Sin embargo, no se registró ningún plaguicida a través de la Ley Federal de Insecticidas, Fungicidas y Rodenticidas (FIFRA) específicamente para su uso contra las esporas de B. anthracis en el momento de la remediación. Además, el uso de un esporicida en la escala requerida no tenía precedentes. Sobre la base de un conjunto limitado de datos (generados en experimentos de prueba antes de la descontaminación del edificio), las condiciones para la limpieza del edificio mediante la fumigación con gas CD debían ser una dosis de 9.000 partes por millón de volumen por hora ([ppmv-h] calculada como la concentración multiplicada por el tiempo de exposición [CT]) sostenida en todo el edificio manteniendo 750 ppmv de gas CD durante 12 h a una temperatura mínima de 75°F, con una humedad relativa (HR) del 75% . Aunque no se dispone de datos directos sobre el papel de la temperatura y la HR, la hidratación de las esporas por ≥75% de HR parece ser un requisito previo para la alta acción esporicida del gas CD. El éxito de una fumigación se determinó indirectamente mediante el uso de indicadores biológicos (IBI) o tiras de esporas; se requirió la eliminación efectiva de todos los IBI (sin crecimiento en el análisis) . En última instancia, se concluyó el éxito de la rehabilitación de la instalación basándose en que no se observaba ningún crecimiento en el muestreo de la superficie del medio ambiente

La generación in situ de gas CD se ha logrado mediante procesos húmedos o secos. En el proceso húmedo, el ácido clorhídrico se hace reaccionar con hipoclorito de sodio para generar cloro, que reacciona inmediatamente con el hipoclorito de sodio para producir CD que se puede extraer de la solución para la fumigación (el método de Sabre Technical Services, LLC). En el proceso seco, el gas de cloro se pasa sobre un lecho de hipoclorito de sodio, lo que resulta en la generación de gas de CD (Tecnología ClorDiSys, Solución ClorDiSys, Inc. [CSI]). Los proveedores que proporcionan ambas tecnologías afirman que generan gas de CD «puro» con un mínimo o ningún tipo de impurezas de subproducto. El proceso húmedo de generación de CD se ha utilizado en todas las fumigaciones de edificios con gas CD para B. anthracis hasta la fecha. En principio, podría utilizarse cualquiera de los dos procesos. Sin embargo, las diferencias en la capacidad de generación para lograr los requisitos de fumigación previstos deben considerarse un factor primordial. Para el uso en laboratorio en una cámara pequeña, los controles de ingeniería del sistema de generación de gas CD seco de calidad conforme a las buenas prácticas de fabricación (BPF) proporcionaron un control automático de la concentración, la temperatura y la HR, lo que se tradujo en una mayor facilidad de uso. Además, la eficacia esporádica comparativa del gas de CD generado por los dos métodos no se ha investigado plenamente en el contexto de la limpieza del interior de los edificios (18).

Los IB se han utilizado ampliamente en todas las fumigaciones de B. anthracis para evaluar la distribución efectiva del gas CD en el espacio tridimensional y para realizar una determinación primaria del éxito de la fumigación . Los BIs se fabrican con discos de papel o de acero, que se inoculan con esporas y se encajan en una envoltura permeable al gas. Se supone que las esporas de Bacillus atrophaeus (1E6 esporas/disco) tienen el mismo grado de resistencia al gas CD que B. anthracis Ames (23, 27). Después de la fumigación, el aumento de la turbidez de un caldo de cultivo debido al crecimiento de una o más esporas viables que quedan en la BI se interpreta como una fumigación infructuosa en la zona en la que la BI estaba ubicada espacialmente. Dos factores confunden el uso de las BI al sacar tales conclusiones: los resultados cualitativos no proporcionan estimaciones del número de esporas viables que quedan en una BI, y no se ha establecido ninguna correlación entre la cinética de inactivación de las esporas de BI y las esporas en las superficies de los edificios. Se ha informado de que una dosis relativamente baja de gas CD, de 1.000 a 2.000 ppmv-h, ha dado lugar a la eliminación total de esporas en los BI (23). Esta dosis es muy inferior a la dosis (9.000 ppmv-h) requerida como objetivo mínimo para las fumigaciones de edificios con gas CD. Por lo tanto, la inactivación satisfactoria de las esporas de BI no indica que se hayan cumplido las condiciones de fumigación de edificios como objetivo. Falta un estudio comparativo para la eliminación de esporas de BI frente a los materiales de interior de edificios.

El objetivo principal de este estudio era investigar la eficacia relativa del gas CD generado por los dos métodos distintos descritos anteriormente para la descontaminación de seis superficies interiores de edificios contaminados con esporas de ántrax avirulentas. Estos materiales incluían alfombras, azulejos de techo, tableros de pared pintados, bloques de hormigón sin pintar, acero de viga en I pintado y madera de pino sin pintar. Un objetivo secundario era evaluar la eficacia relativa de las dosis de CD (CT) generadas por diferentes combinaciones de concentración y tiempo de exposición en la descontaminación de las superficies interiores de los edificios. Además, en este estudio también se determinaron los perfiles de eliminación de esporas de los IBI en relación con las superficies interiores de los edificios. Se espera que el conjunto de la información científica generada aquí proporcione información crítica para los futuros esfuerzos de limpieza de edificios en dos áreas fundamentales: i) los datos científicos para apoyar la selección de los parámetros de fumigación objetivo a fin de obtener el máximo efecto esporicida manteniendo al mismo tiempo los daños colaterales (el edificio y su contenido) al mínimo, y ii) la utilidad y las limitaciones de los IBI para predecir el éxito del proceso de fumigación para la descontaminación de edificios, obviando la necesidad de un costoso y largo muestreo del interior de los edificios.

MATERIALES Y MÉTODOS

Fuentes de material de construcción, preparación de cupones y manipulación.

Se adquirieron cantidades a granel de cuatro de los seis materiales de interior de edificios (alfombra, baldosa de techo, madera de pino y cartón) en una tienda minorista de gran volumen (Home Depot, Aberdeen, MD). Los bloques de cenizas se adquirieron en York Building Materials (Aberdeen, MD). El acero estructural se adquirió en Specialized Metals (Coral Springs, FL). Se cortaron trozos (1,3 por 1,3 cm) de cada material (en adelante denominados cupones) de las secciones interiores de los materiales a granel; los cupones de bloques de cenizas eran de 2 a 2,5 por 1,3 cm. Los cupones de cartón se pintaron con el imprimador de PVA para interiores Speed-Wall de Glidden (Home Depot, Aberdeen, MD), seguido de una capa de pintura de látex Glidden Evermore Interior (Home Depot, Aberdeen, MD). Los cupones de la viga I fueron pintados con la imprimación TT-P-636 Red Oxide Primer (35-147; Colorado Paint). Los cupones de acero de viga I pintados y secos se enjuagaron en etanol al 70%, se lavaron a fondo en agua destilada y se secaron completamente antes de su uso. Los cupones de bloque de cilindro se lavaron en agua (para eliminar los residuos sueltos resultantes del proceso de corte) y se secaron completamente antes de su uso. Antes de la prueba, todos los cupones se esterilizaron en grandes placas de petri de vidrio por autoclave durante 45 minutos usando un ciclo seco.

Cepa bacteriana, cultivo y preparación de esporas.

En este estudio se utilizó una cepa libre de plásmidos de B. anthracis (NNR1Δ1, derivada de NNR1; recibida de USAMRIID, Fort Detrick, MD) (8). La falta de ambos plásmidos se confirmó mediante la amplificación por PCR de los loci de toxicidad y cap (no se muestran los resultados). Los cultivos de caldo se cultivaron en caldo de soja tríptico (TSB), y las enumeraciones de títulos se realizaron utilizando placas de agar de soja tríptico (TSA) después de incubar durante 22 ± 2 h a 37°C. Las esporas se prepararon en placas de agar Lemko y luego se cosecharon como se describió anteriormente (18). El título de las esporas de la suspensión se enumeró haciendo diluciones seriadas 10 veces en agua de peptona tamponada al 0,5% (Becton, Dickinson, y Co., Sparks, MD) y aplicando una alícuota de 0,1 ml entre 10-5 y 10-8 diluciones por triplicado en placas de TSA. Se mezclaron volúmenes iguales de suspensión de esporas y solución de suero bovino fetal estéril al 1% para obtener una reserva de trabajo con un título de 2E8 esporas/ml que contiene un 0,5% de proteína de suero bovino fetal. Todas las existencias de trabajo se almacenaron a 4°C en tubos estériles y se utilizaron dentro de los 30 días siguientes a su preparación.

Inoculación de cupones.

Se inoculó a los cupones estériles una alícuota de 50 μl de suspensión de esporas que contenía aproximadamente 1E7 esporas como siete gotas de 7,1 μl cada una en toda la superficie. Se inocularon las superficies pintadas de acero de viga en I, tablero y techo. Las esporas se secaron durante 16 ± 2 h a 22 ± 2°C en una campana de nivel de bioseguridad 2 (BSL-2). Se inocularon al mismo tiempo los cupones de prueba y de control positivo.

Extracción de esporas de los cupones y enumeración.

Cada cupón fue transferido en tubos estériles desechables de 50 ml que contenían 10 ml de BPW que contenían 0,05% de surfactante Tween 80. Los tubos fueron entonces sonicados durante 10 min y se pusieron en vórtex durante 2 min para desalojar las esporas de la superficie del cupón. La sonicación se realizó utilizando un limpiador ultrasónico de mesa Bransonic (frecuencia de 40 kHz; Bransonic Ultrasonic, Danbury, CT).

Después de la extracción, se realizaron diluciones de 10 veces según se necesitara, y se esparcieron alícuotas de 0,1 ml por triplicado en placas TSA (spread plating). Las placas se incubaron durante 18 a 24 horas a 37°C. El número de UFC se leyó usando un contador de colonias QCount (Spiral Biotech Inc., Norwood, MA) después de 22 ± 2 h de incubación. Para las muestras de prueba fumigadas con un número muy bajo de esporas viables (<10 por placa), se transfirieron alícuotas de 1 ml del tubo de dilución cero por triplicado (3 ml en total) a cada una de las tres placas de petri, seguidas de la adición de 20 a 25 ml de TSA licuado (precalentado a 55°C) a cada placa, y las muestras se mezclaron por medio de un suave remolino rotacional (vertido de placas). Después de 2 a 3 h de solidificación a temperatura ambiente, los platos se invirtieron e incubaron a 37°C. Los recuentos de UFC se leyeron usando un contador de colonias QCount después de 2 y 6 días de incubación.

Generador de gas CD y fumigación de cupones.

En este estudio se utilizaron dos procesos y generadores comerciales para la producción de CD. En el primer proceso, se pasó gas cloro (2% con 98% de nitrógeno) sobre hipoclorito de sodio sólido para generar CD puro (CSI, Líbano, NJ). El Cloridox-GMP (CSI), un sistema generador de gas CD portátil, se utilizó para generar este tipo de CD. El otro generador se adquirió a Sabre Technical Services, LLC (Albany, NY). En este proceso, el CD se produjo a demanda mezclando cantidades controladas de 25% de clorito de sodio, 12,5% de hipoclorito de sodio y 15% de ácido clorhídrico en vacío. El gas de CD se extrajo de esta solución acuosa de CD rica en clorito en un extractor de aire en contracorriente con una eficiencia aproximada de 80 a 90% (del CD disuelto en el líquido).

Para ambos estudios de gas CD, se utilizó una cámara de pruebas de 8 pies (2 pies por 2 pies por 2 pies) construida por CSI con acero inoxidable de grado 316. La cámara de pruebas estaba equipada con sensores de temperatura, HR, presión y CD. Además, la cámara de pruebas contenía cinco antecámaras para facilitar la extracción de una o más placas de petri que contenían los cupones fumigados sin alterar los parámetros del proceso. Cada antecámara tenía una puerta de esclusa interior y otra exterior. Tres ventiladores de circulación instalados en la cámara aseguraban que la atmósfera de la cámara estuviera bien mezclada y fuera uniforme. La circulación del aire en la cámara asegura una distribución uniforme del fumigante en las superficies expuestas. El gas CD fue medido en tiempo real con un espectrofotómetro contenido en la unidad Cloridox-GMP. En el caso del Cloridox-GMP, la concentración de CD en la cámara se controló automáticamente a través de válvulas de control lógico programado (PLC). La regulación de la concentración en la cámara durante el ciclo de fumigación con el generador Sabre se hizo manualmente mediante la supervisión de la concentración en tiempo real en la cámara y la inyección manual de gas CD según fuera necesario. El Cloridox-GMP se utilizó para controlar la temperatura de la cámara y la HR, independientemente del sistema de generación de CD utilizado. Normalmente, se programaba un ciclo en el Cloridox-GMP con preacondicionamiento (rampas de HR al 75% ± 5%), acondicionamiento (30 min a 75% ± 5% de HR), carga (rampas de concentración de CD al punto de ajuste que oscilaban entre 1,4 y 8,4 mg/litro o 500 a 3.000 ppmv) y exposición o esterilización (tiempo de retención durante el cual la HR se mantenía al 75% ± 5% y la concentración de gas CD estaba en el valor objetivo ± 10%), seguido de una fase de aireación. En el caso del generador Sabre, la fase de acondicionamiento se prolongó hasta el final del ciclo (para no avanzar a la siguiente fase), y se mantuvo la temperatura y la HR fijadas para permitir que el experimento (carga y exposición) se realizara manualmente antes de proceder a la aireación mediante el aborto del ciclo. Debido al tamaño relativamente pequeño (8 pies3) de la cámara de fumigación y al uso de tres ventiladores para hacer circular el gas, se supuso que la concentración de CD era relativamente uniforme en el interior de la cámara. Independientemente del método de generación utilizado, la confirmación de la concentración de gas CD en la cámara se realizó cada 60 a 120 minutos durante toda la fase de esterilización utilizando el método estándar 4500-ClO2 E, método amperométrico II (1).

Los cupones de prueba y los cupones de control no inoculados se colocaron en placas de petri (de 15 mm de tamaño). Cada placa contenía cinco cupones de prueba replicados y un blanco de cada tipo de material. Los cupones de prueba y los controles positivos se inocularon con las esporas objetivo, como se ha explicado anteriormente, y los cupones en blanco (no inoculados) se utilizaron para vigilar la contaminación cruzada. Se colocaron placas de Petri en el suelo de la cámara de ensayo antes de iniciar la fumigación. Después de la fumigación durante el tiempo especificado, se colocó una placa de Petri en una de las antecámaras abriendo y cerrando la puerta interior, y se retiró después de que se ventilara la antecámara para eliminar el gas CD residual. Se utilizó una de las cinco antecámaras para cada una de las cinco muestras extraídas durante el ciclo de fumigación. La dosis se calculó como la concentración media (en ppmv) de CD en la cámara durante la fase de esterilización multiplicada por el tiempo de exposición (en horas) de los cupones durante esa fase y se informa en unidades de ppmv-h.

Enumeración de esporas, reducción de registros y manejo de datos.

Las muestras fueron esparcidas o vertidas dentro de las 2 o 3 horas de la extracción de las esporas. Las muestras se almacenaron a 4°C hasta que se contaron las placas. Las placas con recuentos de UFC entre 10 y 300 (promediados a partir de tres placas replicadas) se incluyeron en el cálculo de la enumeración. Las muestras con valores de UFC fuera de este rango se volvieron a colocar en diluciones apropiadas. Dado que sólo una pequeña fracción (1/30) del volumen de extracción de la muestra (0,3 de 10 ml) se analizó mediante el vertido en placa, las muestras con un recuento de UFC de 0 en la dilución más baja se analizaron además mediante el vertido en placa de una tercera fracción del volumen de la muestra (1 ml/placa en tres placas). Este análisis se realizó dentro de las 24 horas siguientes al almacenamiento de la muestra a 4°C. Este procedimiento permitió mejorar considerablemente el nivel de detección de las esporas viables, permitiendo detectar la presencia de tan sólo de una a cinco esporas viables en cada muestra. Para todos los materiales, si una muestra contenía >3 a 5 esporas/10 ml, se esperaría que se observara por lo menos 1 UFC/3 ml en las placas. Se determinaron los valores logarítmicos del número total de UFC/cupón para cada una de las cinco réplicas, y se calcularon los promedios y las desviaciones estándar (DS) a partir de estos cinco valores de réplica. A las muestras con 0 UFC en las tres placas de vertido se les asignó un valor de 1 para obtener un valor logarítmico de 0. La reducción logarítmica se calculó en cada punto temporal dentro de un ciclo de fumigación restando el valor logarítmico medio de UFC de las muestras replicadas fumigadas del valor logarítmico de UFC de todas las muestras replicadas de control positivo para cada tipo de material. Las SD se calcularon mediante este cálculo como la raíz cuadrada de la suma de los cuadrados de las SD para los controles positivos y las muestras fumigadas en cada punto temporal.

Se realizó un análisis unidireccional de la varianza (ANOVA) para responder a la pregunta de si la respuesta temporal era la misma para cada tratamiento. Es decir, ¿hay una pendiente común (disminución del número de esporas viables con el tiempo) o una pendiente diferente según el tratamiento?

Matriz de pruebas experimentales.

En este estudio se realizaron 19 experimentos (ciclos de fumigación). Se realizaron cinco ciclos con el sistema de generación CSI, y 14 con el sistema Sabre. Los experimentos específicos, que indican la tecnología de generación de CD, la concentración de la cámara objetivo, la temperatura media y la HR durante la fase de esterilización, y los momentos en los que se retiraron de la cámara cinco cupones de réplica de cada tipo de material y una BI durante los ciclos de fumigación se resumen en la tabla .

TABLA 1.

Las desviaciones estándar para la temperatura media y la HR fueron <1°C y <3%, respectivamente. cl tiempo cero se define como el inicio de la fase de esterilización de la fumigación.

RESULTADOS

Comparativo de esporas matadas por los dos sistemas de generación de CD.

La eficacia esporádica del gas CD generado por los dos métodos diferentes podría ser diferente debido a los distintos métodos utilizados para su generación y a la posible presencia de diferentes cantidades de contaminantes (7; A. R. Pitochelli, presentado en el Tercer Simposio Internacional, Dióxido de Cloro: Drinking Water, Process Water, and Wastewater Issues, Nueva Orleans, LA, 1995). Se realizaron experimentos de fumigación con ambas tecnologías a una concentración constante de 500 cámara se fijó en 25°C.ppmv de gas CD durante la fase de esterilización del ciclo de descontaminación. Los valores medios de reducción logarítmica (± SD) de estos experimentos con las tecnologías de generación de Sabre y CSI se resumen en la tabla . Los resultados que se muestran son el promedio y la desviación estándar de dos pruebas con la tecnología Sabre y tres con CSI, y cada prueba tiene cinco réplicas de cada tipo de cupón por punto de tiempo. La prueba de medias post hoc de la diferencia menos significativa (LSD) de Fisher (15) mostró que no había ninguna diferencia estadísticamente significativa en los datos debido a la tecnología de generación de CD con un nivel de confianza del 95%. Esta prueba se utilizó para separar los diferentes tratamientos en grupos cuyas medias no eran significativamente diferentes entre sí. Por el contrario, esta prueba encuentra tratamientos cuyas medias también son diferentes entre sí. Se realizó un análisis similar para las dos repeticiones con el CSI y cinco repeticiones totales con la tecnología Sabre (tres repeticiones de hasta 7 h y dos repeticiones de hasta 9 h) con una concentración de CD de 3.000 ppmv (Tabla ). Una vez más, no se apreció ninguna diferencia estadísticamente significativa resultante de la tecnología de generación de CD utilizada. Además de la comparación de los resultados en función de la generación de CD, la diferencia en los valores de reducción logarítmica debido al tipo de material también se muestra en las Tablas y . Los cupones de madera y bloques de ceniza requirieron una exposición más larga para lograr una reducción de 6 log.